微量凱氏定氮法測(cè)定蛋白質(zhì)總含量

一、實(shí)驗(yàn)原理

 天然有機(jī)物（如蛋白質(zhì)和氨基酸等化合物）的總氮量通常用微量凱氏定氮法（micro-kjeldahl method）來(lái)測(cè)定。

當(dāng)被測(cè)的天然含氮化合物與濃硫酸共熱時(shí)分解出氨，氨與硫酸反應(yīng)生成硫酸銨，此過(guò)程稱為消化。由于消化過(guò)程進(jìn)行緩慢，實(shí)驗(yàn)中常添加硫酸鉀和硫酸銅的混合物來(lái)促進(jìn)，硫酸銅是催化劑，硫酸鉀可提高消化液的沸點(diǎn)。氧化劑過(guò)氧化氫也能加速反應(yīng)。消化完成后，在凱氏定氮儀中加入強(qiáng)堿堿化消化液，使碳酸銨分解出氨。用水蒸汽蒸餾法將氨蒸入無(wú)機(jī)酸溶液中，然后再用標(biāo)準(zhǔn)酸溶液進(jìn)行滴定。

 上述過(guò)程的化學(xué)反應(yīng)如下：

        在微量凱氏定氮法中，常用硼酸-指示劑混合液收集氨，氨與溶液中氫離子結(jié)合生成銨離子，使溶液中氫離子濃度降低，指示劑顏色發(fā)生改變，然后用標(biāo)準(zhǔn)無(wú)機(jī)酸滴定，直至恢復(fù)溶液中原來(lái)氫離子濃度，即指示劑變回原來(lái)顏色為止。所用無(wú)機(jī)酸的摩爾數(shù)即相當(dāng)于樣品中氨的摩爾數(shù)，本法適用范圍約為0.2~1mg氨。

       因?yàn)榈鞍踪|(zhì)含氮量通常在16%左右，所以將凱氏定氮法測(cè)得的含氮量乘上系數(shù)6.25，便得到該樣品的蛋白質(zhì)含量。

二、實(shí)驗(yàn)用品

（一）器材

 （1）微量凱氏定氮儀。

 （2）50ml凱氏燒瓶，100ml錐型瓶，50ml酸式滴定管，100ml量筒，100ml容量瓶，

      100ml燒杯，酒精燈。

（二）試劑

   （1）無(wú)水Diethyl Ether（AR）

   （2）粉末硫酸鉀-硫酸銅混合物：K₂SO₄:CuSO₄.5H₂O=3:1、6：1或10：1。

   （3）40%（W/V）NaOH溶液。

   （4）4%（W/V）硼酸溶液。

   （5）0.01mol/L標(biāo)準(zhǔn)鹽酸（用硼砂標(biāo)定）：吸取分析純HCL（比重1.19，約12mol/L）8.5ml，用蒸餾水稀釋至1L，貯于試劑瓶中待標(biāo)定。準(zhǔn)確稱取3份干燥的硼砂，每份0.381~0.383g分別放在150ml三角瓶中，加入20ml蒸餾水使其溶解，加入3滴甲基紅指示劑（0.1g甲基紅溶于250ml水中），用待測(cè)的鹽酸滴定至橙紅色為止，記下鹽酸的滴定體積，通過(guò)計(jì)算即可知道鹽酸的準(zhǔn)確濃度：

（三）、材料

     豆?jié){（市售）。

• 實(shí)驗(yàn)程序

  （一）操作方法

   1.樣品的消化

     在凱氏燒瓶中加入催化劑約50mg,用移液管依次加入3mL均一的豆?jié){和3ml濃硫酸（移液管要接近凱氏燒瓶底部，不使樣品粘附在瓶口或瓶頸）。另取一支凱氏燒瓶加入3ml水代替豆?jié){，其余試劑同上，此為空白。

   將凱氏燒瓶放在通風(fēng)柜內(nèi)的電爐上加熱，火力不要太猛，應(yīng)以使液體保持微沸狀態(tài)為宜。瓶?jī)?nèi)液體逐漸由黃色變?yōu)楹谏^而轉(zhuǎn)為淡黃色，zui后成清澈藍(lán)色溶液，消化即告*，取出燒瓶，冷卻，將瓶?jī)?nèi)液體轉(zhuǎn)移至50ml容量瓶中，加蒸餾水定容至刻度。

 2.儀器的裝置和蒸洗

   按圖9-1裝好凱氏定氮儀，再用蒸氣進(jìn)行蒸洗，以除去NH３和其他干擾物質(zhì)。蒸洗方法如下：　　　　　　　　　　

　 接通冷凝水，打開(kāi)夾子（J） ，往蒸餾瓶（B）內(nèi)加入占球部1/3體積的清水，而后取5ml蒸餾水從小漏斗（A）緩慢地注入反應(yīng)瓶（F），關(guān)上夾子（I），同時(shí)加熱蒸餾瓶（B），蒸餾反應(yīng)瓶?jī)?nèi)的蒸餾水，使其沸騰產(chǎn)生蒸汽。產(chǎn)生的氣體沿導(dǎo)管上升到冷凝管（C），氣體經(jīng)過(guò)冷卻從冷凝管末端（G）流入收集瓶。排出反應(yīng)瓶（F）中的液休，重復(fù)蒸洗2~3次，以便較熟練掌握蒸洗的方法。反應(yīng)瓶（F）中的液體排出的方法：樣品蒸餾完畢后，繼續(xù)加熱使其沸騰，移開(kāi)酒精燈，關(guān)上夾子（I），稍等片刻，由于蒸餾瓶（B）中的蒸汽較反應(yīng)瓶（F）中的多，所以冷卻后蒸餾瓶（B）中的壓力比反應(yīng)瓶（F）的低，反應(yīng)瓶（F）內(nèi)的廢液迅速地從出樣口（H）抽出到反應(yīng)瓶外，隨即自加樣小漏斗（A）往反應(yīng)瓶（F）中較快地倒入一子（K）排出蒸餾瓶中的熱水，關(guān)上夾子（I），稍等片刻，反應(yīng)瓶（F）內(nèi)的液體又迅速地從出樣口（H）抽出，然后打開(kāi)夾子（K）排出蒸餾瓶中的熱水，關(guān)上夾子（K），打開(kāi)夾子（J），往蒸餾瓶（B）中加入1/3球部體積的清水，即可進(jìn)行下一次蒸餾。儀器的安裝和蒸洗過(guò)程中，應(yīng)很好地掌握幾個(gè)夾子的開(kāi)關(guān)關(guān)系，避免漏氣是實(shí)驗(yàn)成敗的關(guān)鍵。

3.標(biāo)準(zhǔn)硫酸銨的測(cè)定

  (1) 吸取10 mL 4%硼酸溶液注入三角燒瓶，加人2滴指示劑，將其傾斜地放在冷凝管末端（G）下，使管末端插人溶液內(nèi)。

 (2) 用移液管準(zhǔn)確吸取5ml標(biāo)準(zhǔn)硫酸銨溶液置于小漏斗（A)，小心打開(kāi)夾子（I），使其緩慢注入反應(yīng)瓶(H)，用1?2 mL蒸餾水沖洗漏斗后放入反應(yīng)瓶(H)。

 (3) 量取5 ml 40% NaOH溶液，置小漏斗(A)，小心打開(kāi)夾子（I），使其緩慢注入反應(yīng)瓶(H)，同樣用1?2 mL蒸餾水沖洗漏斗后放入反應(yīng)瓶(H)，關(guān)上夾子(I)，避免蒸餾過(guò)程氨散失。

 (4) 加熱蒸餾瓶(B)使反應(yīng)瓶?jī)?nèi)液體開(kāi)始沸騰，立即收集氨，當(dāng)三角瓶中溶液由紫紅色變成鮮綠色開(kāi)始記時(shí)，蒸餾5 min后移動(dòng)三角瓶使液面離開(kāi)冷凝管口約1 cm,繼續(xù)收集2~3min，zui后用蒸餾水把末端剩余的氨全部洗到三角瓶中，即算蒸餾完畢。排出廢液，量取5 ml蒸餾水蒸洗反應(yīng)瓶一次，就可以進(jìn)行第二份標(biāo)準(zhǔn)硫酸銨溶液的蒸餾工作。

 (5)將收集的各瓶蒸餾液分別用0.01 mol/L標(biāo)準(zhǔn)鹽酸溶液滴定至藍(lán)色消失，使溶液呈淡桔色為止。 

   用標(biāo)準(zhǔn)硫酸銨溶液連續(xù)測(cè)定3次,3次測(cè)定的終點(diǎn)顏色應(yīng)一致， 滴定數(shù)據(jù)差值不超過(guò)±0.05ml.

 4. 樣品及空白的測(cè)定 

 將3.1操作所得的消化液在定氮儀上進(jìn)行含氮量測(cè)定,方法與標(biāo)準(zhǔn)硫酸銨溶液測(cè)定相同，并進(jìn)行空白測(cè)定。

5.結(jié)果處理